三种融合标签对大熊猫轮状病毒结构蛋白VP6-VP7可溶性表达的影响

大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus,GPRV)是引起幼龄大熊猫腹泻的主要病原,对圈养大熊猫产生了较大的危害。轮状病毒结构蛋白VP6是一种载体蛋白,可介导黏膜免疫反应。VP7是轮状病毒结构蛋白中主要的中和抗原。因此,VP6-VP7的融合表达作为候选抗原对该病的防治具有重要的意义。传统大肠埃希菌原核表达存在表达量低、可溶性差以及纯度低等弊端。本研究使用醛缩酶(EDA)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)3种融合标签,以实现获得表达量高和纯度高的GPRV-VP6-VP7重组表达蛋白。将扩增的VP6、VP7基因片段利用同源重组酶构建到含3种融合标签的表达载体pET21b上,将重组质粒转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)感受态细胞中进行低温诱导表达。用Ni-柱亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE和Image J分析蛋白表达量和可溶性,Western blot分析得到表达的重组表达蛋白正确且具有蛋白活性。实验结果证明,EDA标签能显著促进VP6-VP7蛋白的原核可溶性表达,提高VP6-VP7蛋白表达量。     

基于多反应监测质谱技术的水稻叶片蛋白绝对定量方法

【目的】建立水稻叶片蛋白的多反应监测(MRM)质谱绝对定量方法。【方法】水稻叶片蛋白经含1.0%十二烷基硫酸钠(SDS)的磷酸盐(PBS)缓冲液提取,丙酮沉淀除杂纯化、胰蛋白酶消化,酶解液经液相色谱分离,MRM质谱监测,外标法定量。【结果】向提取缓冲液中加入1.0%SDS可增强水稻叶片中16种靶蛋白和总蛋白质的提取效果;不同有机试剂处理,总蛋白质沉淀量存在显著差异(P<0.05),沉淀能力从强到弱依次为乙腈>丙酮>异丙醇>甲醇>乙醇;对于16种目标蛋白,总体以丙酮沉淀效果最好,其次是异丙醇和乙腈,甲醇和乙醇效果较差。该方法线性范围均达到3个数量级,定量限为0.1~2.5 nmol/L,灌浆期16种水稻叶片蛋白质含量为6.0~2818.1μg/g,相对标准偏差均小于14%。【结论】SDS可显著提高水稻叶片蛋白提取效果,采用丙酮或乙腈可获得较好的蛋白沉淀效果,但不同蛋白质略有差异。结合MRM质谱监测技术可实现水稻叶片蛋白的绝对定量,方法线性范围宽、敏度高、重复性好。     

不同育秧方式对连作晚稻超秧龄机插质量的影响

以甬优538、甬优9号为供试材料,研究了轻多效唑水育秧(T1)、重多效唑水育秧(T2)和轻多效唑旱育秧(T3)三种育秧方式对水稻超秧龄机插的影响。结果表明,与T1处理相比,T2、T3处理的苗高、生物量受到抑制,成秧率变高,漏秧率降低,基本苗数增加;机插后2个品种的抽穗期均推迟,甬优538 T2、T3处理的产量高于T1处理,甬优9号T2、T3处理的产量低于T1处理。     

侵染广东连州葫芦的黄瓜绿斑驳花叶病毒的分子特征 及致病性分析

【目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是侵染瓜类作物的主要病毒之一,对瓜类产业造成巨大的危害。本研究旨在探明侵染广东省连州市葫芦的CGMMV分离物(CGMMV-GDLZ)分子特征及其在系统进化中的地位,并测定其对黄瓜、葫芦和西瓜的致病性,为CGMMV的防控提供理论依据。【方法】从广东省连州市葫芦种植基地采集2个疑似CGMMV侵染的病样以及1个无症状样品,提取总RNA,根据CGMMV参考序列（GenBank登录号：KX883801）设计引物进行RT-PCR检测,引物序列为F：CCACGAGTTGTTTCCTAATGCTG/R：TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT,退火温度53℃,扩增长度890 bp。将CGMMV全长序列分为前后两段,前半段1—3 511 nt,扩增引物序列为F：AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGTTTTAATTTTTATAA TTAAACAAA/R：AGTTCTGCATTAATTGCTATTTGGTAGGCACAGTGGTAG;后半段3 301—6 423 nt,扩增引物序列为F：GTGCGTGCTACCCCGACTCCAATAGGTTTGATTGCCCGTG/R：GGTGGAGATGCCATGCCGACCCTGGGCCCCTACCCGGGGAAAGG。将前后两段PCR产物通过同源重组的方法克隆到pCB301双元载体上,测序得到CGMMV-GDLZ分离物全长序列。利用CGMMV-GDLZ分离物全长序列在NCBI中进行Blast分析,然后通过MEGA7软件对CGMMV-GDLZ以及其他已经报道的CGMMV分离物进行系统进化树分析。将构建好的pCB301-CGMMV侵染性克隆注射接种本生烟验证其侵染性,然后再注射接种黄瓜、葫芦和西瓜的子叶,测定CGMMV-GDLZ分离物的致病性。【结果】RT-PCR结果证实,广东省连州市葫芦病样感染了CGMMV。CGMMV-GDLZ分离物全长序列为6 423 nt,编码4个蛋白,分别为129K复制酶（61—3 495 nt）、186K复制相关蛋白（61—5 007 nt）、运动蛋白MP（4 994—5 788 nt）和外壳蛋白CP（5 763—6 248 nt）。CGMMV-GDLZ核苷酸序列与CGMMV-eWT分离物（GenBank登录号：KY753928）同源性最高,为99.97%。系统进化树分析结果显示,CGMMV-GDLZ分离物与日本、韩国等东亚CGMMV分离物同属Group 1,在遗传距离上与山东、浙江和河南的CGMMV分离物最接近。pCB301-CGMMV侵染性克隆可以系统侵染本生烟,造成本生烟上部叶片出现皱缩、斑驳、凸起等症状,RT-PCR和Western blot进一步确认了侵染性克隆的侵染性。注射接种CGMMV-GDLZ分离物后15 dpi,葫芦和西瓜即可产生斑驳、花叶、突起、生长迟缓等症状,24 dpi时症状更明显。而15 dpi时,CGMMV-GDLZ分离物在黄瓜上的症状不明显,与未接种对照植株几乎没有区别;将植株从控温接种室移入网室中,30 dpi时,黄瓜植株上部叶片开始出现斑驳和花叶,40 dpi时,症状已经非常明显。RT-PCR和Western blot检测进一步确认了上述结果。【结论】侵染广东省连州市葫芦的CGMMV-GDLZ分离物与山东、浙江和河南的CGMMV分离物很可能具有相同的传染源;CGMMV-GDLZ分离物可以侵染本生烟、黄瓜、葫芦和西瓜等作物,但对这些作物的致病性存在差异。     

甘蔗横向种植机补种系统设计与试验

针对甘蔗横向种植机在种植过程中出现的漏播问题,设计了一套基于51单片机的甘蔗实时补种系统。通过对充种、储种、供种、护种及投种过程进行运动学和动力学的仿真分析,确定了影响补种效果的主要因素,设计了补种系统的关键部件。该系统采用AT89C52单片机、3套对射型激光传感器分别对漏种、补种箱和储蔗槽中蔗种余量不足的情况进行信号采集,进行漏种计数显示和实现蔗种余量不足时的报警,步进电机作为动力源,驱动辊耙转动完成补种过程。选取行进速度和补种辊槽数为试验因素,以补种成功率和重置率为补种性能指标,进行了二因素五水平的正交旋转组合试验。结果表明,行进速度对补种成功率的影响极显著,补种辊槽数对补种成功率的影响极显著;利用Excel软件进行了二次回归方程分析,得出当行进速度为3 km/h、补种辊槽数为10个时,补种成功率达到93.97%,重置率为1.69%。设计的实时补种系统性能稳定可靠,解决了播种器工作过程中的漏种问题。     

Effects of post-silking water deficit on the leaf photosynthesis and senescence of waxy maize

Waxy maize is widely cultivated under rainfed conditions and frequently suffers water shortage during the late growth stage. In this study, a pot trial was conducted to examine the effects of post-silking drought on leaf photosynthesis and senescence and its influence on grain yield. Two waxy maize hybrids, Suyunuo 5(SYN5) and Yunuo 7(YN7), were grown under the control and drought(soil moisture content was 70–80% and 50–60%, respectively) conditions after silking in 2016 and 2017. The decrease in yield was 11.1 and 15.4% for YN7 and SYN5, respectively, owing to the decreased grain weight and number. Post-silking dry matter accumulation was reduced by 27.2% in YN7 and 26.3% in SYN5. The contribution rate of pre-silking photoassimilates transferred to grain yield was increased by 15.6% in YN7 and 10.2% in SYN5, respectively. Post-silking drought increased the malondialdehyde content, but decreased the contents of water, soluble protein, chlorophyll, and carotenoid in the leaves. The weakened activities of enzymes involved in photosynthesis(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxylase) and antioxidant system(catalase, superoxide dismutase and peroxidase) reduced the photosynthetic rate(P_n) and accelerated leaf senescence. The correlation results indicated that reduced Pn and catalase activity and increased malondialdehyde content under drought conditions induced the decrease of post-silking photoassimilates deposition, ultimately resulted in the grain yield loss.     

三七根际土壤中皂苷类自毒物质降解拮抗细菌的分离筛选

[目的]筛选出既可降解三七皂苷类自毒物质又能拮抗三七锈腐病菌的细菌菌株,为防治三七病害及克服连作障碍提供生防资源.[方法]利用连续稀释法从健康三七根际土壤中分离可培养细菌,测定细菌菌株在以粗皂苷为唯一碳源培养基上的生长情况,以对峙培养法测定细菌菌株对三七锈腐病菌毁灭柱孢菌(Cylindrocarpon destruc-tans)RS006的拮抗活性;结合16S rDNA测序和形态学特征对活性菌株进行分类鉴定,并通过HPLC测定活性菌株在不同时间内对主要皂苷类自毒物质(R1、Rg1、Re、Rb1和Rd)的降解能力.[结果]从三七根际土壤中分离获得91株细菌分离物,其中17株分离物能在以粗皂苷为唯一碳源的培养基上生长、14株分离物对菌株RS006具有拮抗活性;菌株41既能以三七粗皂为唯一碳源生长,又对菌株RS006具有较强抑制活性.综合菌株41的形态特征和16S rDNA分子鉴定结果,将菌株41鉴定为蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii),编号为PM-41.菌株PM-41对三七主要皂苷类自毒物质R1、Rg1、Re、Rb1和Rd均存在较明显的降解效果.[结论]蒙氏假单胞菌PM-41既能拮抗毁灭柱孢菌又能有效降解三七皂苷类自毒物质,具有防治三七锈腐病和缓解三七连作障碍的生防潜力.     

企鹅珍珠贝F3选育系的珍珠层颜色及生长性状的比较分析

[目的]评价企鹅珍珠贝金唇选育系和白唇选育系的育种性能,为企鹅珍珠贝良种选育及优质珍珠培育提供参考依据.[方法]以海南(H)和广西(G)群体的金唇(J)、白唇(B)选育群体F2为亲本,构建4个自繁选育系(J-HH、J-GG、B-HH和B-GG)和2个杂交选育系(B-HG和J-GH),观察并统计6个F3选育系的珍珠层边缘颜色变异情况,综合比较6个F3选育系的生长性能及珍珠层颜色差异,并比较金唇选育系和白唇选育系左右壳及不同测量位点颜色的差异.[结果]3个金唇选育系群体的贝壳珍珠层颜色变异率为0,3个白唇选育系群体的贝壳珍珠层颜色变异率为2.0%~5.5%,表明白唇表型相对于金唇表型为显性.金唇选育系左壳较右壳颜色更亮、偏黄红、鲜艳,其色差为2.77;白唇选育系右壳较左壳颜色暗、偏蓝绿,其色差为6.01.不论是金唇选育系还是白唇选育系,都是下测量位点比上测量位点颜色更暗、偏蓝绿,但同壳两测量位点的颜色差异较小.3个金唇选育系群体的体质量均显著大于3个白唇选育系群体(P<0.05,下同),金唇选育系与白唇选育系的贝壳珍珠层边缘颜色参数(L*、a*、b*、C*和ho)均存在显著差异.在金唇选育系中,J-HH选育系生长性状及贝壳珍珠层颜色的综合评价值(Pi)均最高,分别为0.390和0.415;在白唇选育系中,B-HH选育系生长性状及贝壳珍珠层颜色的综合评价值(Pi)均最高,分别为0.108和0.722.[结论]6个企鹅珍珠贝F3选育系的生长性能和珍珠层颜色均存在显著差异,其中,J-HH选育系可作为生长和金唇协同选育的最佳选育系,B-HH选育系可作为生长和白唇协同选育的最佳选育系.